一、源自供體腸隱窩的培養(yǎng)方法

隱窩分離：

從成熟個體（如小鼠或人類）中分離出腸隱窩。這通常通過手術(shù)切除腸道組織或活檢取材來實(shí)現(xiàn)。

將分離出的腸隱窩包埋在Matrigel基質(zhì)膠中，以提供細(xì)胞生長所需的支撐。

培養(yǎng)基配制：

配制富含生長因子的培養(yǎng)基，這些生長因子通常包括Wnt3a、EGF、Noggin和gastrin等，它們對腸道類器官的生長和分化至關(guān)重要。

細(xì)胞培養(yǎng)：

將包埋在Matrigel中的腸隱窩放置在富含生長因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

經(jīng)過7~10天的培養(yǎng)，逐漸形成一個腸道類器官結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含多種腸道細(xì)胞類型，如腸上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞。

二、通過定向分化ESC或iPSCs構(gòu)建腸道類器官

細(xì)胞來源：

使用胚胎干細(xì)胞（ESC）或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）作為起始細(xì)胞。

定向分化：

通過特定的分化方案，將ESC或iPSCs定向分化為中腸或后腸組織。

再逐步培養(yǎng)分化出所有主要的腸上皮細(xì)胞類型及腸干細(xì)胞，以模擬腸道發(fā)育過程。

培養(yǎng)基與生長因子：

在分化過程中，需要使用特定的培養(yǎng)基和生長因子來支持細(xì)胞的生長和分化。

三、hPSCs細(xì)胞來源的腸類器官培養(yǎng)方案

Matrigel準(zhǔn)備：

將凍存的Matrigel在4°C下過夜解凍，并均勻滴加在培養(yǎng)板中。然后轉(zhuǎn)移至37°C條件下孵育使其凝固。

hPSCs接種與培養(yǎng)：

將hPSCs接種在包被Matrigel的培養(yǎng)板中，并使用特定的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到約75~85%時，進(jìn)行解離并重新接種。

內(nèi)胚層分化：

使用特定的分化培養(yǎng)基，將hPSCs逐步分化為內(nèi)胚層細(xì)胞。

中腸和后腸分化：

在內(nèi)胚層分化的基礎(chǔ)上，使用特定的分化培養(yǎng)基進(jìn)一步誘導(dǎo)中腸和后腸的分化。

類器官形成與培養(yǎng)：

在顯微鏡下觀察并收集形成的3D結(jié)構(gòu)（即球狀體），并將其接種在含有特定生長因子的腸基質(zhì)膠中。

將混合物接種在培養(yǎng)板中，并放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

每隔一段時間更換腸道生長培養(yǎng)基，以促進(jìn)類器官的生長和分化。

四、注意事項

無菌操作：

在整個培養(yǎng)過程中，需要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，以避免污染。

培養(yǎng)基與生長因子的選擇：

根據(jù)不同的細(xì)胞來源和分化階段，選擇合適的培養(yǎng)基和生長因子。

傳代與冷凍保存：

當(dāng)類器官生長到一定大小時，需要進(jìn)行傳代以維持其生長活性。同時，也可以將部分類器官進(jìn)行冷凍保存以備后續(xù)使用。

觀察與記錄：

在培養(yǎng)過程中，需要定期觀察類器官的生長情況和形態(tài)變化，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)以供后續(xù)分析。

總結(jié)，腸道類器官的培養(yǎng)方法多種多樣，可以根據(jù)具體的實(shí)驗需求和細(xì)胞來源選擇合適的方法。同時，在培養(yǎng)過程中需要注意無菌操作、培養(yǎng)基與生長因子的選擇以及傳代與冷凍保存等關(guān)鍵步驟。